聊一聊數字PCR行業的基本概況

　　PCR（聚合酶鏈式反應）是指利用DNA 聚合酶（如Taq DNA 聚合酶）在體外條件下，催化一對引物間的特異DNA 片段合成的基因體外擴增技術。PCR 是生物體外的特殊DNA 復制，最大的特點是能將微量的DNA 大幅擴增。以實時熒光PCR 技術為例，通過PCR 技術進行分子診斷的主要流程包括：

　　1. 核酸的提取和純化：使用核酸提取試劑從病毒、細菌等中提取出DNA；

　　2. 核酸在引物約束下特異性的PCR 擴增：在提取的DNA 中加入擴增需要的反應液（酶、復制需要的原料、引物等），在PCR 儀中完成擴增過程；

　　3. 擴增產物的檢測：通過熒光標記法檢測DNA 含量，從而判斷病毒DNA 含量，給出診斷結果。

　　PCR 技術最大的特點就是靈敏度高、特異性好、及時方便，在基礎研究以及醫學診斷、法醫學和農業科學等各大領域應用廣泛。在臨床診斷中，PCR 技術具有諸多優勢：靈敏度高，靶細胞檢出率可達1/100 萬，病毒檢測靈敏度≥3RFU，最小細菌檢出率為3 個，檢測樣本純度要低，僅需DNA 粗提??；擴增反應在2-4 小時內完成，使用簡便、快捷。

　　作為臨床診斷的“金標準”技術，PCR 廣泛應用于血站核酸檢測、疾控核酸檢測、臨床核酸檢測等領域，其中，在傳染病診斷和血篩檢測中，PCR 技術能縮短診斷的“窗口期”并且可以定量對病原體進行檢測，相比于傳統的免疫診斷方式，具有不可替代的優勢，基于PCR 技術的分子診斷是醫院對傳染病診斷的“金標準”。

　　PCR 經過三代技術更迭，精確度和靈敏度不斷提高。PCR 技術最早由穆勒于1985 年發明，經歷了第一代定性PCR、第二代定量PCR 和數字PCR 三代技術迭代，其中第二代定量PCR 包括熒光定量PCR（qPCR）以及在其基礎上分化出來的ARMS （突變擴增阻滯系統）和HRM（高分辨溶解曲線）。三代技術的主要差異如下：

　?、?第一代定性PCR 技術：采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產物進行分析，存在交叉污染、檢測耗時長、只能做定性檢測等缺點，目前處于衰退期，已基本被淘汰；

　?、?第二代熒光定量PCR（qPCR）技術：qPCR 在一代定量PCR 的基礎上引入熒光探針標記法從而實現定量檢測，目前發展成熟、應用廣泛、臨床普及率高，為現階段主流應用平臺，正處于從成長期向成熟期過渡的階段，市場增速在20% 以上；

　?、?第三代數字PCR（dPCR）技術：dPCR 是在PCR 原理的基礎上利用芯片和熒光檢測技術進行核酸絕對定量檢測。芯片技術是dPCR 的核心工藝，利用對樣品進行分液處理進而實現“單分子模板PCR 擴增”，達到定量檢測的目的，具有更高的精確度和靈敏度，目前處于導入期，市場增速在10%-15%。

　　數字PCR儀的工作原理是，通過將含有待測樣本的數字PCR反應液分散到成千上萬個獨立的微反應單元中，在PCR擴增后對每個微反應單元中的熒光信號進行判讀，計算出陰性和陽性反應的數量，最后利用泊松分布等統計學公式和軟件對結果進行計算分析，從而實現靶標分子的絕對定量。因此，數字PCR不依賴標準曲線定量，并且不受PCR擴增效率影響，具有更高靈敏度和準確度。